[摘 要]：主张：通过体表检测J9集团胃肠胶囊（GIC）对胚胎幼白鼠幼肠器官型植块成长的作用以索求GIC建复粘膜危险的机理。步骤：体表造就胚胎幼白鼠幼肠器官型植块，并将所有植块分为两组：尝试组和对照组。了局：尝试组的幼肠器官型植块能很好地维持存活，并有大量的单个细胞、细胞克隆以及片状粘膜组织块长出，成长的功夫长，成长状态好；而对照组的幼肠器官型植块均很快归于殒命。二者差距极为显著。结论：GIC可能维持胚胎幼白鼠幼肠器官型植块的存活，并能推进细胞增殖，某种水平上维持组织的齐全性，沉新组合成粘膜组织，此了局可能与GIC激活上皮干细胞有关。

[关键词]：GIC；幼肠植块；成长

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well　in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]： GIC; intestinal explant ;　growth

　　大量临床实际显示，GIC可能也是通过激活粘膜上皮干细胞、推进组织细胞成长的机理实现对危险粘膜建复的，为了证明这一概想，我们特设计了本尝试。

　　一. 仪器、设备、资料、试剂及尝试动物

　　造就箱（美国Forma）、冰箱（江苏长岭）、颠倒显微镜（沉庆光学仪器厂）、超等恒温水浴及恒温电烤箱（沉庆四达）、超净工作台（北京半导体设备二厂）、显微成像分析系统（上？迫穑⑽⒉ü愣獹alanz）、微型推算机（北京沐泽）、光学显微镜（江苏光学仪器厂）、各类型号注射器、12孔造就板（丹麦NUNC）、50ml离心管、Eppendorf离心管、微量加样器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均为法国Gilson）、大幼滴头、玻璃造就皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔滤膜、针头滤器、显微表科器械、各类眼科手术器械、有盖三角烧瓶、有盖幼试管、针头、GIC（J9集团公司出产）、MEM造就基（美国Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和链霉素（华北造药）等。

　　尝试动物：昆明种胚胎幼白鼠

　　二. 尝试步骤：

　　1．取孕16日龄的昆明雌性幼白鼠，颈椎脱臼法正法之，先置于75%乙醇中粗洗一遍（2分钟），再置于75%乙醇中消毒5分钟；

　　2．用眼科剪以及止血钳先剪开雌鼠的腹部皮肤，钝性分离至两侧，充分露出腹壁肌肉，而后幼心剪开腹壁全层，切勿伤及内脏及幼鼠胚胎；

　　3．剪开子宫，从宫腔中取出胚胎鼠，置入无菌平皿中；

　　4．用双抗-冷PBS将胚胎鼠体表洗涤两次，每次１分钟；

　　5．用显微表科剪刀将胚胎鼠的腹壁剪开，再用显微表科镊子夹起鼠近胃端幼肠（蕴含十二指肠和空肠），截。瞔m左右；

　　6．用双抗-冷PBS将胚胎鼠幼肠陆续洗涤两次，每次1分钟；

　　7．用显微表科剪刀将肠管纵行切开，充分露出粘膜面；

　　8．用双抗-冷PBS将胚胎鼠幼肠陆续洗涤两次，每次1分钟；

　　9．将鼠幼肠置于含双抗（青、链）的MEM造就液中冲刷2次，每次1分钟；

　　10．将鼠幼肠剪成极幼的器官型植块，大幼约1mm×1mm；

　　11．将植块置于12孔造就板的造就孔中央，每孔5块，距离约2mm，布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴造就板的表表；

　　12．沿着造就孔的边缘，每孔中参与约0.5ml的齐全MEM造就液，勿使造就液与植块接触；

　　13．将造就板置于37，５％造就箱中预孵育１.5幼时；

　　14．每孔加齐全MEM造就液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘起，尝试组加GIC；

　　15．尝试组和对照组同步等量换液，每次去掉原液的1/２左右, 再参与一样量的新鲜MEM造就液；

　　16．用颠倒显微镜观察植块成长情况，用显微成像纪录分析系统纪录所观察的了局，并用推算机保留图像。

　　三．尝试了局

　　细胞造就110天内的汇报了局：尝试组和对照组的肠组织植块在造就之初，均能固定在造就孔中央，但随着造就功夫的推移，植块逐步脱离造就孔底部平面，游离飘浮于深层造就液中，悬浮的地位依然靠近造就孔底部，但依然集中于造就孔中央，少数位于周边，植块的大幼和状态险些没有变动，但在造就的第１０天左右，组织块就起头变得膨松，而后逐步裂解为很幼的组织块，并最终成为肉眼不易觉察的组织块，这时在视野中发现了单个细胞以及细胞克隆。在造就的第２０天，对照组中的细胞以及细胞克隆逐步殒命，而尝试组细胞仍旧成长优良，单个细胞越来越多，在视野中四处可见，以位于中央部位的最多，细胞圆形，细胞核清澈。细胞呈典型活细胞状态。越向表越少，边缘险些没有，细胞克隆数也逐步增多。每个克隆所含有的细胞个数随着功夫的推移也越来越多。上述了局注明含15%胎牛血清的MEM造就基无法提供给组织块相宜而充足的营养，而GIC作为高级细胞造就基可能提供给细胞合理而充足的营养，保障了组织和细胞的活性。

　　下面为造就过程中，尝试组和对照组的对比图谱，能够深刻反映两组的差距。

图１　造就第24天。图1A为对照组，图1B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是大量单个的幼肠组织细胞，但其中没有克隆。
图2　造就第30天。图2A为对照组，图2B为尝试组。对照组中为位于视野中央的大量幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是即将形成克隆的细胞。
图3　造就第38天。图3A为对照组，图3B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是一块较为齐全的幼肠粘膜组织。
图4　造就第42天。图4A为对照组，图4B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是一块幼肠粘膜组织。

图5　造就第50天。图5A为对照组，图5B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是两块幼肠粘膜组织。
图6　造就第85天。图6A为对照组，图6B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是一块幼肠粘膜组织。
图7　造就第90天。图7A为对照组，图7B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是大量的分散成长的幼肠组织细胞。
图8　造就第97天。图8A为对照组，图8B为尝试组。对照组中的幼肠组织细胞或细胞克隆已经殒命，尝试组中显示的是一块由细胞衔接起来的片状结构。

　　GIC可使离体肠粘膜细胞在造就液中沉新衔接组合成粘膜组织

　　此刻通常均选取Trowell法进行体表幼肠粘膜组织的器官型造就，此法从人体或动物经口腔取材，取材部位为十二指肠远端和空肠近端，将取出的粘膜（不成能是纯正的粘膜组织，应该还蕴含粘膜基层、肌层等等，这与J9集团做法一致），将粘膜放在金属网格上，而后粘膜连同网格一路置于多孔造就板中央的孔，其它孔中置入无菌生理盐水浸泡过的无菌纱布以便维持湿度，盖好，置入一个密关容器中，通95%的氧气和5%的，37造就箱中造就。这是目前通用的步骤。但此法有显著的弊端，即步骤较为繁琐，取材量有限，通常每次不能多于10块活组织，多了容易引起胃肠路出血，取材量受到限度，我们此刻选取的步骤对其进行了很大的简化，直接从新正法的胚胎动物体内获得无菌幼肠粘膜组织，取材过程极容易节造量，也容易节造部位，出格方便快捷。

　　由于体表造就目前还没有合适的人为合成造就基，现有的报路体表造就的幼肠粘膜组织维持存活功夫较短，不论是用RPMI-1640造就基（附加葡萄糖、胰岛素、谷氨酰胺和胎牛血清），还是用Trowell造就基（附加胎牛血清），细胞均最多存活24~48幼时，之后就会出现退化和殒命，通常很难超过48幼时，造就基中若是不加血清，功夫更短，6~12幼时会退化坏死，由于植块存活功夫短，给尝试者提供的检测功夫也很短，使多项目检测不成能，只能检测那些用药之后当即就出现的反映，持久效应无法观察，使尝试受到了很大限度。而在本尝试中我们使用的含有GIC细胞高级造就基直接突破了现有造就基方面的限度，能够持久造就离体肠粘膜组织，能够持久在光镜下直接观察GIC对粘膜成长的影响。

　　本尝试中，GIC对肠粘膜组织的细胞；ぷ饔靡驳玫搅讼灾逑；对于造就过程中观察到的片状粘膜组织，之所以能存在很久功夫，并且其内的细胞成长优良，是GIC对细胞表基质的正常代谢产生了影响，细胞表基质是维系细胞相互衔接的基础。

　　为什么胃粘膜可能在这种环境中持久成长呢？有两个原因：一是GIC是营养丰硕的细胞造就基及优良的细胞；ぜ，另一个是肠路粘膜组织中有粘膜上皮干细胞，GIC启动了干细胞，使干细胞得以较长功夫地成长。

　　对于第一个问题的诠释：

　　GIC有效成分中含有的亚油酸是细胞必须的脂肪酸，是组成细胞生物膜不成短缺的组分，是皮肤、粘膜及深层组织危险后进行建复的沉要资料；有效成分中含有的多种氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸以及多种脂类物质、维生素、微量元素，为肠粘膜细胞的成长提供了丰硕的营养；有效成分还拥有抗病原微生物作用，对多种细菌、病毒、真菌、原生物都有较强的抑造作用，同时拥有抗炎作用；药物中的有效成分还能够推进细胞的能量代谢，蛋白质及核酸合成和生物膜转运等职能；缓慢开释，使细胞持续得到不变的营养供给。

　　GIC的抗氧化作用阐发为抗自由基、不变细胞膜。自由基是宽泛存在于各类化学反映中的活跃基团，倘若其产生过量，从而引发所谓的自由基链式反映，则将导致细胞膜多不鼓和脂肪酸的脂质过氧化，所产生的大量脂质过氧化物会危险细胞膜及细胞内的大分子蛋白质与核酸，对细胞造成危险。有效成分中维生素E的抗自由基职能是由于其自身结构拥有还原性，进而捉拿自由基从而阻断自由基链式反映，起到对机体的；ぷ饔，而其自身则经过维生素C和含硫氨基酸的再生而还原或转变为醌类化合物。大量维生素E的存在可使细胞处于流动性高、通透性缜密的状态。这除了可；つど洗罅康亩嗖还暮椭舅岵槐谎趸，还与其能够；つさ鞍椎幕钚越峁褂泄。

　　对于第二个问题的诠释：

　　肠路粘膜组织中有粘膜上皮干细胞，在相宜前提下可能持久成长，GIC有能力启动干细胞使之活化。肠路粘膜的上皮组织起源于上皮干细胞（epithelial stem cell）， 用-胸腺嘧啶脱氧核苷（-TdR）象征放射自显影法观察瞬间象征后的肠腺细胞发现，上皮干细胞位于或靠近肠隐窝的部位。为了维持动态平衡，这些干细胞不休转化为短暂滋生细胞并向中段移动，最后要么分化为拥有吸收职能的刷状缘上皮细胞，要么分化为肠路内排泄细胞。分化后的细胞最后殒命并且从肠绒毛上脱落下来并进入肠腔，任何干细胞都拥有成长滋生的能力，它们是一群分化较低的细胞，这是干细胞与分化细胞显著的分歧，体表造就中最容易增殖的正常细胞是干细胞，干细胞属于未分化细胞，只管脱离了体内成长的微环境，但依然拥有较强的增殖能力Ｄ芄欢涎杂捎贕IC拥有激活表皮干细胞的能力，对粘膜干细胞也应该有相应的激活能力。

　　至于成长的细胞的性质，我们以为肯定是粘膜细胞，重要原因有两个：一是由于上皮干细胞在体表有较强的增殖职能，这已经为很多钻研了局所证实，肠壁其它细胞均不具备这种能力，本尝试所用的标本中，除粘膜细胞表，数量最多的应该是肠壁的滑润肌细胞，滑润肌细胞在体表可进行有限的增殖，但不能持久增殖。本尝试齐全能够排除滑润肌细胞成长的可能性，由于造就从头至尾未曾发现状态呈条形或梭形、分列呈束状的滑润肌细胞成长。再次，目前还没有发现滑润肌干细胞，这也是滑润肌在体表不易持久成长的沉要原因。其它细胞如粘膜基层疏松结缔组织中的动脉、静脉、淋巴管、神经纤维和粘膜下神经丛等组织的细胞能如此成长的可能性极幼。第二个原因是优势成长的问题，当某种细胞出格容易成长的时辰，其它细胞的成长就会受到肯定水平的抑造或者齐全被抑造，本尝试中肠粘膜细胞在成长中占优势或绝对优势。

参　考　文　献

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